一种含有五味子木脂素类化合物的纳米结构脂质载体及其制备方法和测定方法

技术领域

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种含有五味子木脂素类化合物的纳米结构脂质载体及其制备方法和测定方法。

背景技术

老年痴呆又称阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease)，是以认知功能障碍、情感障碍及精神行为异常为主要临床特点的一种慢性进行性精神衰退性疾病。随着人口老龄化的进程加速，老年痴呆的发病率逐年升高。目前我国老年痴呆病人为600万人，预测到2025年将增加至1009万人。同时，肝病在全球范围内一种常见疾病，且发病率较高，例如酒精性脂肪肝，酒精性肝炎，肝硬化，肝纤维化及肝癌等。上述这两种疾病均严重地影响到人们健康水平和生活质量，同时也会给患者家庭和社会都带来巨大的负担，已成为一个不可忽视的社会问题。

纳米结构脂质载体(Nano-structured Lipid Carriers，NLC)是新一代的脂质纳米粒，其以一定比例的液态油或混合基质替代了固体脂质纳米粒中的固体基质，使固体脂质规则的晶格结构被扰乱，增加了纳米粒中不规则晶型的比例，从而可容纳更多药物分子，提高了药物的包封率和载药量，避免了贮藏过程中包封药物被排挤泄漏。

五味子醇甲(schisandrol A)，是五味子木脂素类化合物的一种，是从中药南北五味子中分离得到的一种木脂素类化合物，其分子式为C₂₄H₃₂O₇，相对分子质量432.5，难溶于水，生物利用度低，且代谢快，限制了其在临床上的应用。现代药理研究表明，五味子醇甲可通过减轻脑组织神经元变性、脱失，改善突触功能、抑制小胶质细胞的活化、抗氧化损伤等多种途径对中枢神经系统疾病起神经营养及保护作用，对老年性痴呆、癫痫及帕金森等疾病有显著的治疗效果，是一种极具潜力的治疗阿尔茨海默病的药物。

经查询专利及文献，目前尚未见到有关含有五味子木脂素类化合物(例如五味子醇甲)的纳米结构脂质载体的研究报道。

发明内容

针对五味子木脂素类化合物(特别是五味子醇甲)难易溶于水、口服生物利用度较低等缺点，本发明提供一种含有五味子木脂素类化合物的纳米结构脂质载体及其制备方法。

因此，本发明的一个主要目的是提供一种含有五味子木脂素类化合物的纳米结构脂质载体。

本发明的另一主要目的是提供上述含有五味子木脂素类化合物的纳米结构脂质载体的制备方法。

本发明提供的含有五味子木脂素类化合物的纳米结构脂质载体，其包含以下组分及其含量：

所述五味子木脂素类化合物包括：五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酯甲、五味子酚、戈米辛D、戈米辛J、戈米辛G、当归酰戈米辛H中的一种或多种。

优选地，所述五味子木脂素类化合物为五味子醇甲。

其中，所述单硬脂酸甘油酯为固体脂质、中链甘油三酸酯为液体脂质、泊洛沙姆188为乳化剂。本发明人经过大量研究发现，该三种成分组合使用，制备的纳米结构脂质载体为均一的、澄清透明的乳蓝光胶体，性能优异。

优选地，所述含有五味子木脂素类化合物的纳米结构脂质载体，其包含以下组分及其含量：

在该含量时，所述纳米结构脂质载体的形态、平均粒径、包封率和载药量进一步改善。

所述含有五味子木脂素类化合物的纳米结构脂质载体为圆整、规则的球形，平均粒径较小，分布均匀，包封率和载药量较高，即平均粒径为88～128nm，PDI值为0.20～0.22，包封率为87～90％，载药量为2.1～2.8％。

所述含有五味子木脂素类化合物的纳米结构脂质载体在0～4h累积释放率为52～56％，在24h释放为64～68％。

在一个具体实施方式中，所述含有五味子木脂素类化合物的纳米结构脂质载体，其包含以下组分及其含量：

在该含量时，所述纳米结构脂质载体的形态、平均粒径、包封率和载药量最佳。

本发明提供的含有五味子木脂素类化合物的纳米结构脂质载体的制备方法，包括以下步骤：

(1)将五味子木脂素类化合物、单硬脂酸甘油酯和中链甘油三酸酯混合并加热至50℃～90℃，作为油相；

(2)在泊洛沙姆188中加入水，超声搅拌均匀后加热至50℃～90℃，作为水相；

(3)搅拌下，将上述水相滴加入同温度的油相中；搅拌的时间为5min～25min；搅拌的速度为300r/min～900r/min，恒温搅拌制成初乳；趁热将初乳用超声波细胞破碎仪超声分散3min～20min，室温自然冷却固化即得。

优选地，油相的加热温度为75±1℃；水相的加热温度为75±1℃；搅拌的时间为10min；搅拌的速度为900r/min；超声分散的时间为10min、功率为750W、振幅为100％、每超声3秒间隔3秒。

此外，本发明提供一种药物组合物，其包含上述含有五味子木脂素类化合物的纳米结构脂质载体，以及药学上可接受的辅料。

优选地，所述药物组合物可以为片剂、胶囊剂、颗粒剂、冻干粉等。

一种冻干制剂，其包含上述含有五味子木脂素类化合物的纳米结构脂质载体，以及基于该纳米结构脂质载体重量的5％～10％的海藻糖。所述冻干制剂表面光洁平整、饱满，再分散性好，稳定性好。

优选地，所述冻干制剂的预冻温度为-80℃，预冻时间为12h；冻干时间为24h。

另外，本发明提供上述含有五味子木脂素类化合物的纳米结构脂质载体在制备治疗阿尔茨海默症或肝病的药物中的用途。

此外，本发明提供一种含有五味子木脂素类化合物的纳米结构脂质载体中五味子醇甲的测定方法，包括以下步骤：

色谱条件：色谱柱：C₁₈柱，5μm，4.6×250nm；流动相：65:35(v/v)甲醇-水；流速：1.0mL/min；检测波长：250nm；柱温：40℃；进样量：10μL；

精密称取五味子醇甲对照品适量，置量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度线，即得五味子醇甲对照品储备液，置4℃冰箱中保存备用；

精密量取五味子醇甲纳米结构脂质载体至量瓶中，加甲醇超声破乳并定容至刻度，取适量该溶液在10000r/min离心10min，0.22μm的微孔滤膜滤过后即得供试品溶液；

分别取上述对照品溶液和供试品溶液，在上述色谱条件下分别进样进行测定。

本发明提供的含有五味子木脂素类化合物的纳米结构脂质载体中，组分及其含量之间相辅相成、协同作用，可以增加五味子木脂素类化合物的溶解性能，延长其作用时间，且具有良好的稳定性、较高的生物利用度和较低的药物毒副作用，同时其平均粒径、包封率、载药量等指标良好，不易发生异构和降解，具有良好的稳定性。

附图说明

图1-1为空白纳米结构脂质载体的HPLC测定图谱；

图1-2为五味子醇甲对照品溶液的HPLC测定图谱；

图1-3为五味子醇甲纳米结构脂质载体的HPLC测定图谱；

图2为五味子醇甲标准曲线；

图3为五味子醇甲纳米结构脂质载体的透射电镜照片；

图4为五味子醇甲纳米结构脂质载体的粒径分布图；

图5为五味子醇甲纳米结构脂质载体的体外释放曲线。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来解释说明本发明。本领域技术人员应当理解，这些实施例仅用于解释说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

缩写词：五味子醇甲(Schisandrin，SCH)；纳米结构脂质载体(Nanostructurelipid carrier，NLC)；多分散系数(Polydispersity index，PDI)；X射线衍射(X-raydiffraction，XRD)；单硬脂酸甘油酯(Glyceryl Monostearate，GMS)；中链甘油三酸酯(Medium chain triglycerides，MCT)；泊洛沙姆188(Poloxamer188)；五味子醇甲纳米结构脂质载体(SCH-NLC)。

仪器：高效液相色谱仪LC-20AT(日本岛津)，BT125D电子天平(赛多利斯科学仪器，北京有限公司)，Milli-Q型超纯水制备仪(法国Millipore公司)，电热恒温水浴锅(天津泰斯特仪器有限公司)，KQ5200DE型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)，HJ-3数显恒温磁力搅拌器(国华电器有限公司)，超声波细胞粉碎机隔音箱(南京星辰生物科技有限公司)，离心机(eppendorf，Centriguge 5424)，Nano-ZS型Zetasizer激光粒度仪(英国Malvern公司)，透射电子显微镜(JEM-1400型，日本JEOL公司，80kv)；冻干机(Alpha2-4LDplus)；德国Bruker D8Advance X射线衍射仪。

实施例1：含有五味子醇甲的纳米结构脂质载体的制备

处方如下：

将五味子醇甲和脂质(单硬脂酸甘油酯和中链甘油三酸酯)混合并水浴加热至75±1℃，作为油相；在泊洛沙姆188中加入注射用水，超声搅拌均匀后加热至75±1℃，作为水相；磁力搅拌下将水相滴加入同温度油相中，恒温搅拌10min，搅拌速度为900r/min，制成初乳，趁热用超声波细胞破碎仪超声分散10min(功率为750W、振幅为100％、每超声3秒间隔3秒)，室温自然冷却固化即得含有五味子醇甲的纳米结构脂质载体(SCH-NLC)。

实施例2：含有五味子醇甲的纳米结构脂质载体的制备

处方如下：

制备方法同实施例1。

实施例3：含有五味子醇甲的纳米结构脂质载体的制备

处方如下：

制备方法同实施例1。

实施例4：含有五味子醇甲的纳米结构脂质载体的冻干制剂的制备

取实施例1中制备得到的SCH-NLC，加入10重量％的甘露醇作为的冻干保护剂，然后在-80℃预冻时间12h；之后冻干24h，即得含有五味子醇甲的纳米结构脂质载体的冻干制剂。

实施例5：HPLC分析方法的确立

色谱条件：色谱柱：ZORBAX SB-C₁₈(5μm，4.6×250nm)；流动相：甲醇-水(65:35)；流速：1.0mL/min；检测波长：250nm；柱温：40℃；进样量：10μL。

专属性考察：精密称取SCH对照品适量，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度线，即得0.3mg/mL的SCH对照品储备液，置4℃冰箱中保存备用。精密量取0.5mL SCH-纳米结构脂质载体(NLC)至10mL量瓶中，加甲醇超声破乳并定容至刻度，取适量该溶液在10000r/min离心10min，0.22μm的微孔滤膜滤过后即得SCH-NLC。同法制得空白NLC供试品溶液。分别取对照品溶液、供试品溶液，在上述色谱条件下分别进样10μL，记录色谱图，结果见图1-1～1-3。图1-1为空白纳米结构脂质载体的HPLC测定图谱；图1-2为五味子醇甲对照品溶液的HPLC测定图谱；图1-3为五味子醇甲纳米结构脂质载体的HPLC测定图谱。

可以看出：SCH-NLC的保留时间与对照品保留时间一致，在该检测条件下，空白NLC对SCH的含量测定无干扰，该方法专属性好。

线性关系考察：精密量取SCH对照品储备液适量，用甲醇配成浓度分别为7.73μg·m>-1、15.45μg·m>-1、30.90μg·m>-1、61.80μg·m>-1、92.70μg·m>-1的SCH标准系列溶液，按上述色谱条件进行分析，记录峰面积。以SCH的质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线，得线性回归方程Y＝21468X+8548.6，R²＝0.9998，标准曲线见图2。图2为五味子醇甲标准曲线。结果表明：SCH在7.73～92.70μg·m>-1线性关系良好。

精密度试验：精密吸取质量浓度为7.73μg·m>-1、30.90μg·m>-1、92.70μg·m>-1低、中、高三种浓度的标准溶液，于一天内连续测定五次，计算日内精密度；以上样品一天进样一次，连续测定五日，计算日间精密度。结果见表1和表2。

表1日内精密度结果(n＝5)

表2日间精密度结果(n＝5)

由表可知，本发明所建立的HPLC检测方法日内、日间精密度均良好(RSD<3％)，符合方法学要求。

稳定性试验：将新制备的供试品溶液置于室温下，于0、4、8、12、24h时进样测定，考察样品稳定性。结果见表3。结果表明，五味子醇甲供试品溶液在24h之内很稳定。

表3稳定性试验结果

重复性试验：取同一批样品，平行制备供试品溶液6份，进样测定，计算含量。结果见表4。结果表明该方法重复性良好。

表4重复性试验结果

回收率试验：精密吸取0.25mL、1mL、2mL已知浓度的SCH对照品溶液于10mL容量瓶中，分别加入0.5mL空白NLC与3mL流动相，超声至NLCs全部溶解，再加入流动相定容至刻度，配制成浓度为7.73、30.90和61.80μg/mL的低、中、高三个浓度梯度的样品溶液，0.22μm滤膜过滤，按上述方法检测样品，重复3次，计算回收率(见表5)。由测定结果可知，平均回收率均在96％以上，RSD小于3％，表明该方法回收率符合方法学的要求，制剂辅料对五味子醇甲的测定无影响。

表5回收率试验结果

测试例1：形态观察

取适量实施例1中制备得到的SCH-NLC滴在喷碳铜网表面，使液体尽量铺满整个铜网，以1.0％醋酸双氧铀染色后，用滤纸吸走多余的液体，自然干燥后置于透射电镜下观察形态，见图3。图3为SCH-NLC的透射电镜照片。可以看出，所述纳米结构脂质载体为圆整、规则的球形。

实施例2和3中制备得到的SCH-NLC具有与实施例1中制备得到的SCH-NLC相似形态。

测试例2：粒径的测定

在室温条件下取实施例1中制备得到的SCH-NLC适量，经过稀释后，采用Nano-ZS纳米激光粒度仪测定所制SCH-NLC的粒径及分布，测定温度25℃(n＝3)，结果见图4。结果表明，纳米粒的粒度分布呈单峰，平均粒径为88nm，PDI为0.20，粒径分布的范围较窄。

经测定，实施例2中制备得到的SCH-NLC，纳米粒的粒度分布呈单峰，平均粒径为96nm，PDI为0.21，粒径分布的范围较窄。

经测定，实施例3中制备得到的SCH-NLC，纳米粒的粒度分布呈单峰，平均粒径为128nm，PDI为0.22，粒径分布的范围较窄。

测试例3：包封率与载药量的测定

本实验采用超滤离心法测定实施例1中制备得到的SCH-NLC的包封率和载药量。精密量取SCH-NLC分散液0.5mL，置3万截留相对分子质量的离心超滤管内管中，于10000r/min离心10min，外管滤液置于5mL量瓶中，甲醇定容至刻度，过0.22μm微孔滤膜，按HPLC条件进行测定含药量，为W游离。另取0.5mL分散液置10mL量瓶内，甲醇超声破乳30min，定容至刻度，离心取上清液过0.22μm微孔滤膜，按HPLC条件进行测定含药量，为W加入药量。按以下公式计算包封率和载药量：

EE％＝(W加入药量－W游离)/W加入药量×100％

DL％＝(W加入药量－W游离)/(M－W游离)×100％

式中，EE为包封率，DL为载药量，W加入药量为纳米粒脂质载体分散液中五味子醇甲的加入量(g)，W游离为HPLC法测得游离药物的量(g)，M为纳米粒脂质载体的总质量(g)。结果见表5。

表5 SCH-NLC包封率的测定结果

结果：实施例1中制备得到的SCH-NLC的包封率为89.13％，载药量为2.74％。

经测定：实施例2中制备得到的SCH-NLC的包封率为87.40％，载药量为2.46％。

经测定：实施例3中制备得到的SCH-NLC的包封率为88.90％，载药量为2.11％。

测试例4：体外释放考察

本研究采用透析袋法对实施例1中制备得到的SCH-LC的体外释药特性进行研究。具体方法如下：实验前将透析袋中浸泡12h至扩散平衡。分别精密量取2mL SCH-NLC溶液，装入透析袋中，并将透析袋两头系紧，置于200mL的含0.3％(w/v)Tween80的pH7.4PBS释放介质中，37℃，75rpm/min的转速振摇，分别于0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24h时取样2mL，并迅速补充等量同温的释放介质。样品过膜后进样测定含量，计算各时间点SCH的累积释放率，并以累积释药百分率对时间作图，绘制其释放曲线。另精密吸取含药量相等的药物溶液作为对照，操作同上。体外释放曲线如图5所示。由图5可知，SCH-NLC在前4h内快速释放，将近52.1％的药物从NLC中释放，SCH原料药释药相对较快，在10h内释放94％；SCH-NLC在24h内累积释放达到64.4％，初期存在突释现象，随后药物持续缓慢释放，与SCH原料药相比具有良好的缓释特性，可见将药物制成纳米结构脂质载体有一定缓释作用。

经测定：实施例2中制备得到的SCH-NLC在0～4h累积释放率为53.6％，在24h释放为66.2％。

经测定：实施例3中制备得到的SCH-NLC在0～4h累积释放率为55.3％，在24h释放为67.8％。

基于以上发明内容的描述，本领域技术人员能够全面地应用本发明，所有相同原理或类似的改动均应视为包括在本发明的范围之内。