一种靶向脾脏的纳米递送载体

技术领域

本发明涉及分子药物及其制备技术领域，尤其涉及靶向药物的递送载体等相关技术。

背景技术

脂质纳米粒一般由可电离的脂质，辅助脂质，胆固醇，和聚乙二醇修饰的脂质等组成。脂质纳米粒最初主要用于siRNA的递送。与腺相关病毒和慢病毒等病毒载体相比，脂质纳米粒等非病毒载体具有更优的安全性。以脂质纳米粒为载体的siRNA药物在2018年被FDA批准上市，其给药方式为静脉滴注，提示脂质纳米粒作为核酸类药物递送载体的安全性和有效性。目前，脂质纳米粒已成为最常用的mRNA疫苗递送载体，在新型冠状病毒疫苗的开发中，以脂质纳米粒为载体的mRNA疫苗已获批上市，用于新型冠状病毒的防治。尽管起步较晚，用于肿瘤免疫治疗的mRNA脂质纳米粒疫苗发展迅速，且已有多项研究进入临床试验阶段。脂质纳米粒可保护mRNA免受体内外RNA酶降解，改善mRNA在体内的递送及DCs等抗原提呈细胞中的表达。装载mRNA的脂质纳米粒静脉注射后主要在肝脏表达，mRNA在脾脏等免疫器官的表达不足限制了mRNA肿瘤疫苗的免疫活性，提示脂质体作为mRNA疫苗递送载体仍需要进一步改造。

脾脏是机体最大的外周免疫器官，具有造血、贮血和过滤作用，也是接受抗原刺激产生免疫应答的场所。脾内定居着大量淋巴细胞和其他免疫细胞，抗原进入脾脏之后，可被抗原提呈细胞摄取并提呈给T细胞，诱导T细胞活化和增殖，产生致敏T淋巴细胞。淋巴结作为外周免疫器官，同样具有过滤和清除异物的作用，能处理外来异物性抗原产生免疫应答并被应用于肿瘤免疫治疗领域。然而，淋巴结清除癌细胞的能力较低，且其是针对来自淋巴液中的抗原产生免疫应答的场所。与淋巴结不同，脾脏是针对血液中的抗原产生免疫应答的场所，且90％左右的循环血液要经过脾，脾脏的这种生物学特性使得利用靶向递送技术将经静脉注射的肿瘤抗原递至脾脏，通过诱导快速的抗肿瘤免疫应答，发挥高效地抗肿瘤作用成为可能。

近年来，研究者开始尝试将抗原至脾脏发挥免疫抗肿瘤作用。有研究者通过简单调整阳离子脂质体与mRNA比例将抗原mRNA递送至脾脏发挥疫苗抗肿瘤活性的研究报道，但后续无相关的报道，可能是阳离子脂质体的毒性及临床实验中疫苗的免疫抗肿瘤效果不佳。也有研究者将DNA递送至脾脏内B细胞发挥预防性的免疫抗肿瘤活性。此外，有研究者通过调整纳米递送载体的粒径，将蛋白/多肽抗原递送至脾脏发挥免疫抗肿瘤作用，尽管有一定的抗肿瘤效果，这种策略递送抗原至脾脏的效率不高，且细胞毒性T淋巴细胞的应答强度并不清楚。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种靶向脾脏的纳米递送载体，通过对脂质纳米粒进行全新设计与调整，改善其内容物如mRNA等活性药物成分在脾脏的表达，安全高效的实现药物/营养物的脾脏靶向施用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种靶向脾脏的纳米递送载体，其为经过人工修饰的脂质纳米粒，所述脂质纳米粒所采用的基础载体材料包括但不限于：Dlin-MC3-DMA、DSPC、Chol、DMG-PEG；所述递送载体中还包含对所述脂质纳米粒进行修饰的功能性脂肪酸，所述功能性脂肪酸同时具备如下生物学和/或药物特性：脾脏靶向性(靶向性)；目标机体自有性(安全性)；降低目标机体代谢细胞摄取所述递送载体的能力/潜力(高效性)。

作为本发明的一种优选技术方案，所述功能性脂肪酸为硬脂酸(stearic acid，SA)和/或其类似物及衍生物。

作为本发明的一种优选技术方案，所述递送载体采用沉淀法进行制备，其中功能性脂肪酸的摩尔含量为10％-80％，优选为60％-80％。

作为本发明的一种优选技术方案，所述递送载体所采用的基础载体材料为Dlin-MC3-DMA、DSPC、Chol和DMG-PEG的组合物。

作为本发明的一种优选技术方案，所述递送载体采用沉淀法进行制备，其中各组分的摩尔份数为：Dlin-MC3-DMA 13-20份，DSPC 2.5-4.1份，Cholesterol 10-15.6份，DMG-PEG 0.3-0.7份，SA 63-70份。

作为本发明的一种优选技术方案，所述递送载体采用沉淀法进行制备，其中各组分的摩尔份数为：Dlin-MC3-DMA 15-18份，DSPC 3.0-3.6份，Cholesterol 12-13.6份，DMG-PEG 0.45-0.55份，SA 65-68份。

作为本发明的一种优选技术方案，所述递送载体采用沉淀法进行制备，其中各组分的摩尔份数为：Dlin-MC3-DMA 16.7份，DSPC 3.3份，Cholesterol 12.8份，DMG-PEG 0.50份，SA 66.7份。

作为本发明的一种优选技术方案，所述递送载体用于递送以脾脏为靶器官的药物、抗原、免疫调节剂、其他活性成分，单一成分或任意组合。

作为本发明的一种优选技术方案，所述递送载体靶向脾脏内的树突状细胞。

作为本发明的一种优选技术方案，所述目标机体为包括人体在内的哺乳动物。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

本发明采用硬脂酸修饰纳米脂质粒，制备得到一种脾脏靶向性纳米递送载体，提高了纳米递送载体的脾脏靶向性。本发明纳米递送载体的功能材料脂肪酸来源于天然产物，制备成本低廉，有利于工业化生产和应用。本发明提供的纳米递送载体显示出良好的廓形，接近球形，同时具有良好的贮存稳定性，可适用于药物(化药和生物药)的靶向给药系统，在科研和医药实用中均具有重要的实际意义。

附图说明

图1为脾脏靶向性药物体内作用示意图。

图2为本发明纳米递送载体与其他对照纳米递送载体的体内脾脏靶向性结果示意图。

图3为硬脂酸修饰后降低递送系统肝脏分布的数据图，从中能够直接看到修饰前后的肝脏分布和表达。

图4为本发明纳米递送载体与其他对照纳米递送载体的肝细胞摄取结果示意图。

图5为本发明纳米递送载体的贮存稳定性检测结果。

图6为本发明纳米递送载体的微观形态和粒径及电位的检测结果示意图。

具体实施方式

以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。

在以下实施例的描述中，为了说明而不是为了限定，提出了诸如特定系统结构、技术之类的具体细节，以便透彻理解本申请实施例。然而，本领域的技术人员应当清楚，在没有这些具体细节的其它实施例中也可以实现本申请。

应当理解，当在本申请说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素和/或其集合的存在或添加。

还应当理解，在本申请说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。

另外，在本申请说明书和所附权利要求书的描述中，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本申请说明书中描述的参考“一个实施例”或“一些实施例”等意味着在本申请的一个或多个实施例中包括结合该实施例描述的特定特征、结构或特点。由此，在本说明书中的不同之处出现的语句“在一个实施例中”、“在一些实施例中”、“在其他一些实施例中”、“在另外一些实施例中”等不是必然都参考相同的实施例，而是意味着“一个或多个但不是所有的实施例”，除非是以其他方式另外特别强调。术语“包括”、“包含”、“具有”及它们的变形都意味着“包括但不限于”，除非是以其他方式另外特别强调。

实施例1、脾脏靶向性药物(如：mRNA纳米疫苗)体内作用途径概述

参见图1，为脾脏靶向性mRNA纳米疫苗体内发挥肿瘤免疫治疗效果的作用示意图。硬脂酸修饰的脂质纳米粒mRNA新型纳米疫苗递送系统静脉注射后能将其装载的抗原mRNA靶向递送至脾脏内抗原递呈细胞树突状细胞特异性表达，该mRNA新型纳米疫苗递送系统改善mRNA表达的同时刺激抗原提呈细胞活化，促进抗原提呈细胞将抗原分子提呈给T细胞，T细胞增殖、分化，产生抗原特异性的效应T细胞，由效应T细胞杀伤肿瘤细胞，最终发挥强效的免疫抗肿瘤作用。

实施例2、纳米递送载体的制备

本实施例制备靶向脾脏纳米递送载体的具体方法如下：分别量取相应处方量的Dlin-MC3-DMA、DSPC、CHO-HP、DMG-PEG2000或者硬脂酸(SA)储备液，混匀后补加相应体积的无水乙醇备用，将处方量的mRNA溶解在一定体积的碳酸盐缓冲液中，溶解脂质的乙醇溶液和溶解mRNA的碳酸盐缓冲液按照1:3的体积比例迅速混匀，室温孵育30min左右，之后利用超滤的方法除去乙醇即得。(普通纳米递送载体的制备方法与上述靶向脾脏纳米递送载体的制备方法类似。)

首先设计不同含量硬脂酸修饰的纳米递送载体。该纳米递送载体中各组成的用量如下表1所示。

表1不同含量硬脂酸修饰的纳米递送载体的处方组成

在上述研究的基础上，进一步设计不同含量硬脂酸修饰的纳米递送载体。优化的纳米递送载体中各组成的用量如下表2所示。

表2优化的硬脂酸修饰的纳米递送载体的处方组成

实施例3、纳米递送载体的脾脏靶向性

采用6-7周龄的正常雌性C57BL6/C小鼠的进行体内分布研究，每组3只小鼠。静脉注射至小鼠体内，LUC-mRNA的用量为4μg/只。注射后小鼠自由饮食饮水。静脉注射6h后，腹腔注射luciferin substrate 200μL。7min之后对小鼠执行安乐死，分离肝、脾和肺等脏器，考察不同含量硬脂酸修饰纳米递送载体静脉注射后在肝脏、脾脏和肺等部位的表达。

试验结果参见图2。图2显示了不同含量硬脂酸修饰脂质纳米粒mRNA新型递送系统的体内mRNA递送行为。图中，A为配方为A的IVT LUC-mRNA体内主要脏器表达的代表性图片，B、C和D分别为肝脏、脾脏和肺脏表达信号的定量统计结果，E为肝脏、脾脏和肺脏表达信号在总表达信号的比例。F为配方为B的IVT LUC-mRNA体内主要脏器表达的代表性图片，G、H和I分别为肝脏、脾脏和肺脏表达信号的定量统计结果，J为肝脏、脾脏和肺脏表达信号在总表达信号的比例。

由图A-E可知，配方为A的不同含量硬脂酸修饰脂质纳米粒mRNA新型递送系统的体内靶向性研究试验结果显示：未经肪酸修饰的脂质纳米粒主要将mRNA递送至肝脏表达，此外，脾脏也有一定的mRNA表达；脂肪酸的加入能够改变脂质纳米粒的体内mRNA递送行为，具体表现为脂肪酸的加入可以降低mRNA在肝脏的表达，一定程度上增加mRNA在肝脏的相对富集；尽管脂肪酸的加入未能完全降低脂质纳米粒的mRNA肝脏递送行为，但上述数据提示我们脂肪酸的加入可以降低mRNA在肝脏的表达，硬脂酸修饰的脂质纳米粒可能具有将mRNA递送至脾脏表达的潜力，值得进一步地研究。

由图F-I可知，配方为B的的硬脂酸修饰的脂质纳米粒的mRNA新型递送系统体内靶向性研究试验结果显示：经过脂质纳米粒mRNA递送系统中硬脂酸加入量的系统优化，硬脂酸修饰的脂质纳米粒能够显著降低脂质纳米粒的mRNA肝脏递送行为，将mRNA特异性递送至脾脏表达；上述数据提示我们基于肝脏脂肪酸代谢策略构建脾脏靶向性脂质纳米粒mRNA新型递送系统的想法是可行的。

未经硬脂酸修饰的脂质纳米粒主要将mRNA递送至肝脏表达，此外，脾脏也有一定的mRNA表达；硬脂酸的加入能够改变脂质纳米粒的体内mRNA递送行为，具体表现为脂肪酸的加入可以降低mRNA在肝脏的表达，一定程度上增加mRNA在肝脏的相对富集。优选方案制备的递送系统体内靶向性研究试验结果显示：硬脂酸的比例为66.7％时，其修饰的脂质纳米粒能够显著降低脂质纳米粒的mRNA肝脏递送行为，将mRNA特异性递送至脾脏表达，而硬脂酸的比例进一步增加至75％时，虽然递送系统也能将mRNA靶向性递送至脾脏表达，但是mRNA编码蛋白的表达量显著降低。

实施例4、纳米递送载体的肝细胞摄取特性

首先，采用利用Cy5标记的胆固醇替换部分胆固醇的方法制备Cy5标记的靶向脾脏的纳米递送载体(SLNPs)和Cy5标记的普通纳米递送载体(LNPs)，按照Cy5标记胆固醇20μg/mouse的剂量进行静脉注射，2h后对小鼠执行安乐死，分离小鼠的肝脏和脾脏等主要脏器，使用小动物活体成像仪进行拍照，之后使用研磨的方式制备单细胞悬液。进行后续的相关检测。

每支流式管中加入100μL的单细胞悬液(每只流式管细胞数量约为2×106)，每支流式管中加入1μL anti-mouse CD16/32，混匀后4℃条件下孵育10min，之后相应流式管中分别加入1μL APC-R700-Anti-mouse-CD45，FITC-Anti-mouse-CD3，BV510-anti-mouseB220，PE-Anti-mouse-CD11b和PercP-Cy5.5-Anti-mouse-CD11c在4℃条件下避光染色45min，达到孵育时间后使用无菌PBS洗涤细胞3遍，细胞重悬于0.3mL的无菌PBS中进行流式检测分析，检测脾脏中各细胞亚群摄取Cy5标记的靶向脾脏的纳米递送载体(SLNPs)和Cy5标记的普通纳米递送载体(LNPs)的情况。

具体检测结果见图3-4。可见，肝脏实质细胞(CD45-)摄取硬脂酸修饰的递送系统较普通递送系统显著降低，具体地，摄取硬脂酸修饰的脂质纳米粒mRNA新型递送系统显著减少的细胞主要为非免疫细胞(肝脏实质细胞，CD45-)，其次为B细胞和巨噬细胞。考虑到肝脏中主要是CD45-的非免疫细胞，CD45阳性免疫细胞的比例不足10％，故硬脂酸修饰的脂质米粒递送系统较普通的脂质纳米粒mRNA新型递送系统显著降低脏实质细胞介导的。详细分述如下。

图3显示了装载IVT LUC-mRNA的Cy5标记的硬脂酸修饰的脂质纳米粒mRNA新型递送系统的体内IVT LUC-mRNA体内表达和分布结果。图中，A为IVT LUC-mRNA在体内各脏器的表达情况，B为IVT LUC-mRNA在体内各脏器表达的统计结果，C为Cy5标记的硬脂酸修饰的脂质纳米粒mRNA新型递送系统在体内各脏器的分布情况，D为Cy5标记的硬脂酸修饰的脂质纳米粒mRNA新型递送系统在体内各脏器分布情况的统计结果。

根据图3的结果：Cy5标记的硬脂酸修饰的脂质纳米粒mRNA新型递送系统静脉注射至小鼠体内后，能够将IVT LUC-mRNA特异性递送至脾脏表达；而分布结果显示Cy5标记的硬脂酸修饰的脂质纳米粒mRNA新型递送系统却主要在肝脏分布，值得注意的是，硬脂酸修饰的脂质纳米粒mRNA新型递送系统在肝脏的分布较普通脂质纳米粒mRNA递送系统显著降低，提示我们基于肝脏脂肪酸代谢特征设计脾脏树突状细胞靶向性的硬脂酸修饰的脂质纳米粒mRNA新型递送系统是可行的。

图4显示了肝脏免疫细胞(CD45+)和非免疫细胞(CD45-)摄取Cy5标记的硬脂酸修饰的脂质纳米粒mRNA新型递送系统和普通脂质纳米粒mRNA递送系统的流式细胞仪检测结果。图中，A为流式细胞术检测肝脏中不同细胞亚群的策略，B和C分别为肝脏中非免疫细胞亚群摄取Cy5标记的硬脂酸修饰的脂质纳米粒mRNA新型递送系统和普通脂质纳米粒mRNA递送系统的代表性流式点状图和统计结果。D和E分别为肝脏中免疫细胞亚群摄取Cy5标记的硬脂酸修饰的脂质纳米粒mRNA新型递送系统和普通脂质纳米粒mRNA递送系统的代表性流式点状图和统计结果。

根据图4的结果：肝脏细胞摄取硬脂酸修饰的脂质纳米粒mRNA新型递送系统较普通的脂质纳米粒mRNA新型递送系统显著降低，具体地，摄取硬脂酸修饰的脂质纳米粒mRNA新型递送系统显著减少的细胞主要为非免疫细胞，考虑到肝脏中主要是CD45-的非免疫细胞，CD45+免疫细胞的比例不足10％，故硬脂酸修饰的脂质纳米粒mRNA新型递送系统较普通的脂质纳米粒mRNA新型递送系统显著降低是肝脏实质细胞介导的。图4的实验结果直接证明了本文基于肝脏脂肪酸代谢设计脾脏树突状细胞靶向性的硬脂酸修饰脂质纳米粒mRNA新型递送系统是可行的。

实施例5、纳米递送载体的贮存稳定性

新制备的靶向脾脏的纳米递送载体平均分为若干份，4℃条件下保存，分别于第0、7、15、30天取样，采用6-7周龄的正常雌性C57BL6/C小鼠，利用小动物活体成像仪对靶向脾脏的纳米递送载体的表达活性进行研究。

每个时间点都分为PBS组和靶向脾脏的纳米递送载体组，每组2只小鼠。静脉注射至小鼠体内6h后，腹腔注射luciferin substrate 200μL。分离小鼠肝脏、脾脏和肺等主要脏器，通过考察不同贮存时间点靶向脾脏的纳米递送载体的表达活性研究其贮存稳定性。

结果如图5所示。图5显示了mRNA新型递送系统4℃贮存的体内表达活性。根据图5，4℃条件下放置30天时，脾脏靶向性的硬脂酸修饰的脂质纳米粒mRNA新型递送系统的脾脏靶向性无任何变化，同时其递送mRNA至脾脏表达的作用也没有降低，提示硬脂酸修饰的脂质纳米粒mRNA新型递送系统在4℃条件下具有较好的贮存稳定性，能够保持mRNA新型递送系统的体内表达行为。这一结果将方便脾脏靶向性的硬脂酸修饰的脂质纳米粒mRNA新型递送系统的体内应用。

实施例6、纳米递送载体的微观形态

将靶向脾脏的纳米递送载体(B5)胶体溶液稀释后滴至专用铜网上，静置约5min后除去多余胶体溶液，滴加2％(w/v)磷钨酸染液染色5min，除去多余染液，静置干燥，之后使用投射电镜观察其微观形貌并拍照。

结果如图6-A所示。图6A显示了脾脏靶向性mRNA新型递送系统的微观形貌。根据图6A，mRNA新型递送系统的粒径范围主要分布在100nm左右，呈类球形，无粘连，粒径分布均一。

实施例7、纳米递送载体的粒径和电位检测

量取一定体积的靶向脾脏的纳米递送载体(B5)，用纯化水稀释至浓度，于激光粒度分析仪中测靶向脾脏的纳米递送载体的粒径和表面电位。

结果如图6-B和6-C所示。图6显示了脾脏靶向性mRNA新型递送系统粒径和电位B为粒径，C为表面电位。根据图6，mRNA新型递送系统粒径为150nm左右(B)，电位为-10mV左右(C)。

在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述或记载的部分，可以参见其它实施例的相关描述。

以上所述实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围，均应包含在本发明的保护范围之内。