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鸡Visfatin蛋白的原核表达、纯化及其活性研究

         

摘要

本试验旨在通过克隆Visfatin基因,将其在原核表达系统中表达并纯化,通过3T3-L1细胞的分化验证其活性,成功获得鸡重组Visfatin蛋白.以AA肉仔鸡肝组织总RNA为模板,qRT-PCR扩增Visfatin基因,转化进入pGEM(R)-T载体,再与原核表达载体pET-30a连接转化,获取含pET-30a-Visfatin重组质粒的E.coli BL21(DE3)表达菌株.以IPTG诱导重组菌株,优化表达条件,SDS-PAGE鉴定表达情况.采用镍离子亲和层析对Vis-fatin蛋白进行纯化,Western blot鉴定表达蛋白,并通过3T3-L1细胞的分化情况鉴定表达蛋白Visfatin的活性.结果,通过Nco Ⅰ、Xho Ⅰ酶切获得的结果与预期目的条带大小相符,成功构建pET-30a-Visfatin表达载体.SDS-PAGE检测结果表明,在培养基pH为8.0,IPTG终浓度为0.4 mmol·L-1,30℃条件下,诱导10~12 h时可溶性蛋白表达量最大.通过镍离子层析纯化Visfatin蛋白,在SDS-PAGE的60 ku处可见一条与预期一致的蛋白条带.Western blot证明纯化蛋白可与6*His标签特异性结合.油红O染色结果表明,与对照组相比Visfatin诱导的3T3-L1细胞有更多的脂滴形成.qRT-PCR结果显示,在3T3-L1细胞分化过程中,Visfatin作用下标志基因PPARγ、aP2、FAS和C/EBPα的表达量显著增加(P<0.05).本研究成功建立了一套标准化的鸡Visfatin重组蛋白表达程序,获得了具有生物活性的鸡Visfatin,为其在家禽领域的进一步研究奠定了基础.

著录项

  • 来源
    《畜牧兽医学报》 |2016年第9期|1785-1794|共10页
  • 作者单位

    河南农业大学牧医工程学院,河南省家禽种质资源创新工程研究中心,郑州450002;

    河南农业大学牧医工程学院,河南省家禽种质资源创新工程研究中心,郑州450002;

    河南农业大学牧医工程学院,河南省家禽种质资源创新工程研究中心,郑州450002;

    河南农业大学牧医工程学院,河南省家禽种质资源创新工程研究中心,郑州450002;

    河南农业大学牧医工程学院,河南省家禽种质资源创新工程研究中心,郑州450002;

    河南农业大学牧医工程学院,河南省家禽种质资源创新工程研究中心,郑州450002;

    河南农业大学牧医工程学院,河南省家禽种质资源创新工程研究中心,郑州450002;

    河南农业大学牧医工程学院,河南省家禽种质资源创新工程研究中心,郑州450002;

    河南农业大学牧医工程学院,河南省家禽种质资源创新工程研究中心,郑州450002;

  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 chi
  • 中图分类 遗传、育种;
  • 关键词

    鸡重组Visfatin; 克隆; 原核表达; 条件优化; 3T3-L1;

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