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炎症性肠病的免疫学发病及免疫调节剂治疗作用机制的研究

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前言

第一部分蛋白质组学研究半抗原诱发的结肠炎模型中淋巴细胞的蛋白表达谱

第二部分P38 MAPK通路参与半抗原诱发的结肠炎淋巴结T细胞免疫应答

第三部分肠泰有效部位对TNBS诱导的大鼠结肠炎治疗作用机制的研究

全文总结

参考文献

致谢

综述 NF-κB在肠道炎症和免疫应答中的作用

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摘要

淋巴细胞作为免疫调节的中心环节，在炎症性肠病的发生和持久化中起重要作用。本课题采用半抗原诱发大鼠结肠炎模型，用蛋白质组学方法研究了淋巴细胞的蛋白表达差异谱。进一步研究了p38 MAPK信号通路在淋巴细胞免疫应答和细胞因子分泌中的作用。同时采用流式细胞术、RT-PCR及ELISA方法对中药肠泰有效部位治疗结肠炎的作用机制进行了研究。结果显示与细胞周期、增殖、信号转导、炎症、凋亡和代谢相关的蛋白分子参与了TNBS诱导的结肠炎中淋巴细胞的免疫应答过程。尤其是一系列与凋亡相关蛋白在结肠炎发病中起重要作用。P38 MAPK通路参与了TNBS诱发的结肠炎中肠系膜淋巴结T淋巴细胞免疫应答，该通路对IL-2、IFN-γ等细胞因子的表达进行了调控。中药复方肠泰有效部位可调节T淋巴细胞亚群比例、降低炎性介质和促炎细胞因子的分泌而发挥对结肠炎的抗炎和免疫调控作用，进而抑制炎症的发生。 炎症性肠病(IBD)是一种病因尚不明确的慢性非特异性肠道炎症性病变，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。其发病多于遗传、环境及免疫反应异常有关，是一种多基因参与的作用于免疫系统和靶器官的疾病，但是其病因和发病机制至今尚未完全阐明，在治疗上仍存在一些问题，例如有部分患者对氨基水杨酸类、激素和免疫抑制剂等药物治疗不敏感以及药物存在毒副作用等。因而，深入研究其发病机制将是十分有意义的。目前，免疫因素在炎症性肠病的发病学中最为肯定，也是该病的发病机制研究中与治疗目标最接近者。众多资料显示，作为免疫系统重要组成部分的淋巴细胞在炎症性肠病的发病机制中起重要作用。淋巴细胞活化相关分子与信号接头分子在调节细胞免疫中尤为重要。失调的淋巴细胞相关分子将导致免疫缺陷、耐受的破坏、异常淋巴细胞发生和炎症。因而，研究炎症性肠病中淋巴细胞一系列差异表达蛋白及淋巴细胞免疫应答中信号转导通路对于深入研究该病的免疫发病机制及寻找新的药靶有重要意义。 本课题采用三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇溶液灌肠诱导大鼠结肠炎模型，运用免疫组化、电镜等技术对肠系膜淋巴结淋巴细胞的细胞增殖程度和形态学进行分析；采用蛋白质组学技术分离分析了结肠炎模型中淋巴细胞的差异表达蛋白，并用Real-time RT-PCR对其进行验证；Western blot法、ELISA法研究了p38 MAPK通路对结肠炎T淋巴细胞Th<,1>细胞因子表达的调控；采用流式细胞术、ELISA及RT-PCR技术探讨了中药肠泰有效部位对于结肠炎的治疗作用及其抗炎和免疫调节的作用机制。主要结果如下： 1、蛋白组学法研究 结肠炎中淋巴细胞差异蛋白表达谱。用半抗原 TNBS/乙醇溶液灌肠诱发大鼠结肠炎模型，造模第七天，肉眼观察：肠系膜淋巴结异常肿大；电子显微镜观察肠系膜淋巴细胞超微结构的变化：淋巴细胞增生活跃，胞浆丰富、内质网扩张、多见分裂相，并可见巨噬细胞、树突状细胞与淋巴细胞间有紧密接触。表明在给予 TNBS后，可诱导肠系膜淋巴结淋巴细胞的免疫应答，肠系膜淋巴结为肠粘膜免疫的主要效应部位；免疫组化检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达，结果显示在造模第七天，PCNA 的表达量最高，可持续到第十天，说明了肠系膜淋巴结淋巴细胞增殖活跃；分离纯化大鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞，提取淋巴细胞总蛋白，双向电泳技术分离出 1,000 多个蛋白点，采用PDQuest软件分析得到26个差异表达的蛋白，其中17个蛋白高表达，9个蛋白低表达。另采用MALDL-TOF-MS/MS质谱鉴定出其中的22个蛋白。并用Real-time RT-PCR方法对部分差异蛋白进行了验证。 2、P38 MAPK通路对结肠炎Th<,1>型细胞因子表达的调控 诱导结肠炎模型，分离纯化肠系膜淋巴结T细胞，用蛋白质印迹方法测定p38蛋白磷酸化水平，ELISA法测定细胞上清液中细胞因子IL-2、TNF-a、IFN-γ的蛋白浓度，结果显示，结肠炎模型组p38蛋白磷酸化水平与细胞因子含量均高于正常对照组(p<0.05)，加入特异性p38 MAPK抑制剂SB203580处理后，这些指标均较模型组显著降低。表明p38 MAPK通路参与结肠炎中T淋巴细胞免疫应答，该途径对细胞因子IL-2、IFN-γ的表达进行了调控。 3、中药复方肠泰有效部位对结肠炎的治疗作用机制研究 诱导大鼠结肠炎模型，给予中药肠泰有效部位(11.4g原药材/kg大鼠)治疗，结果发现，治疗组动物明显改善模型大鼠腹泻、体重下降及血便等结肠炎症状，显著降低结肠湿重、MPO值、大体形态损伤评分及组织损伤评分。进一步对其抗炎和免疫调节作用机制进行了研究。应用流式细胞仪法观察外周血T淋巴细胞亚群及CD4<'+>/CD8<'+>比值的变化，结果发现外周血CD3<'+>细胞百分含量无明显变化，模型组CD4<'+>/CD8<'+>比值明显高于其他各组，而药物治疗组与正常对照组间无显著性差异。结果表明，肠泰有效部位能通过调节和改变T淋巴细胞亚群比例而发挥在IBD中的免疫调控作用。采用EIASA法测定结肠组织及血浆中Th<,1>型促炎细胞因子IL-2、TNF-a、．IFN-γ的含量，肠泰有效部位下调造模后结肠组织和血浆中升高的促炎细胞因子。同时，RT-PCR检测参与炎症的一系列重要炎性因子在结肠组织中的mRNA表达量，TNBS诱导结肠炎后结肠组织炎性因子：IL-1β、MIP-2、COX-2、iNOS 的mRNA水平明显升高，药物治疗组显著降低它们的水平。结果表明，肠泰有效部位通过抗炎和免疫调节机制达到对结肠炎的理想治疗目的。

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